酶切反應條件的優化當建立
NEB內切酶酶切反應體係時有幾個關鍵因素需要考慮。下麵整理了以下有關NEB內切酶反應的經驗和技巧。
標準反應體係：
限製性內切酶10units*
DNA1μg
10XNEBuffer5μl(1X)
總反應體係50μl
溫育溫度因酶而異
溫育時間60分鍾
*足夠切割所有類型的DNA。
省時酶切反應體係：
限製性內切酶1μl
DNA1μg
10XNEBuffer5μl(1X)
總反應體係50μl
溫育溫度因酶而異
溫育時間5-10分鍾*
*具有省時酶切特性的內切酶也可以過夜反應而沒有星號活性。
NEB內切酶
•從冰箱取出後請一直置於冰上。
•酶zui後加入到反應體係中。
•加入酶之前將反應混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然後在離心機中快速離心。切忌振蕩混勻。
•一般情況下，我們推薦使用5-10單位酶量/μgDNA，基因組DNA用10-20單位酶量消化1小時。
•NEB推出一係列的高保真（HFTM）內切酶，為建立酶切反應體係提供了更多便利。
•如果使用RE-Mix®，請參考2013﹒2014商品目錄276頁的操作方法。
DNA
•避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過多鹽離子的汙染。推薦在純化過程中多清洗幾次。
•甲基化的DNA會抑製某些酶的切割效率。
緩衝液
•使用終濃度為1X的緩衝液。
•BSA已被添加到NEB緩衝液1.1、1.2、1.3和CutSmart緩衝液中，無需額外添加BSA。
•在不需要BSA即可達到*活性的酶切反應中如果加入BSA也不會影響酶切效果。
反應體係
•建議在50μl反應體係中消化1μg底物DNA。
•加入內切酶的量應不超過總體積的10%，以避免甘油過量引起的星號活性。
•內切酶貯存液中的添加物（如：甘油和鹽）和底物溶液中尚存的殘餘物（如：鹽、EDTA或乙醇）會導致小體積反應出現問題。下述為小體積反應技術指南。
酶切反應體係的選擇
*當內切酶用量小時，用推薦稀釋液稀釋後使用。
**使用10μl反應體係時，溫育時間不要超過1小時，以防蒸發。
溫育時間
•標準體係溫育1小時，省時酶切體係溫育5-15分鍾。
•使用省時內切酶。
•許多內切酶都可以用更少單位的酶消化16小時。
終止反應
若消化後的DNA不需要進行後續實驗操作：
•用終止液終止反應[50%甘油、50mMEDTA（pH8.0）和0.05%溴酚藍]（如NEB#B7021）。按每50μl反應體係中加入10μl的比例進行。
若消化後的DNA需要進行後續實驗操作：
•用熱失活法（以確定該酶能否熱失活）。
•若該酶不能熱失活，利用商業化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內切酶。
貯存
•大多數內切酶建議保存在-20℃。隻有少數NEB內切酶若貯存時間超過30天建議保存在-70℃。
•10XNEBuffer也應保存在-20℃。
穩定性
•NEB每4個月都會對所有的內切酶進行活性檢測。使用期限標注在每管產品的標簽上。
•在任何情況下，都應盡可能的避免將酶置於高於-20℃的溫度下。
對照反應
如果在切割底物DNA時遇到了問題，建議加入以下對照實驗：
•酶切對照DNA（含有多個已知內切酶切割位點的DNA，如LambdaDNA或腺病毒-2DNA），以檢測內切酶的活性。
•如果對照DNA能夠被切割而實驗中的底物DNA不能，可以將這兩種DNA混合在一起再進行酶切，以檢測實驗用的底物DNA中是否存在抑製反應的物質。如果確實存在某種抑製因子（通常為鹽、EDTA或酚），則混合之後對照DNA也不能被切割。
星號活性
•當內切酶在非zui適條件下使用時可能會產生星號活性。
•可以通過以下方法降低星號活性：使用高保真（HF）內切酶、縮短溫育時間、使用省時內切酶或者增大反應體積。
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