規模化分選“純淨”種子細胞的新方法
中國是世界人口大國，因創傷(shang) 、疾病、遺傳(chuan) 、衰老等因素造成的組織和器官缺損、衰竭或功能障礙的患者人數位居世界各國，以藥物和手術治療為(wei) 基本支柱的經典醫學治療手段，已不能滿足臨(lin) 床醫學的巨大需求。細胞治療可以通過移植對應組織的細胞來修複發生了病變、衰老或損傷(shang) 的組織器官，從(cong) 而更新其生理功能，為(wei) 組織器官缺損所致的疾病提供全新的治療手段。但是，這種方法需要有足夠數量對應類型的細胞，通過常規的捐獻方法很難達到臨(lin) 床上對數量和類型的要求，因而麵臨(lin) 著細胞來源短缺的嚴(yan) 重問題，這在很大程度上阻礙了細胞治療的發展步伐。幹細胞在體(ti) 外培養(yang) 條件下能夠維持自我更新，還能夠被誘導成為(wei) 機體(ti) 幾乎所有細胞類型，因而可以為(wei) 臨(lin) 床疾病的細胞治療提供重要的種子資源細胞。特別是間充質幹細胞的出現，其具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，因取材方便、體(ti) 內(nei) 植入後不良反應較弱等優(you) 點而備受關(guan) 注，成為(wei) 細胞替代治療的理想種子細胞，在細胞治療中有更廣闊的應用前景。
統計發現，間充質幹細胞可用於(yu) 治療自身免疫病、神經係統、消化係統、骨骼及運動係統等多種疾病，且近年來間充質幹細胞用於(yu) 疾病治療的案例逐年增加，並有顯著效果，因而推動間充質幹細胞臨(lin) 床應用是對人類健康做出重大貢獻的舉(ju) 措。除此之外，胚胎幹細胞（ES）和誘導多功能幹細胞（iPS）通過誘導都能夠分化成為(wei) 不同類型的細胞，都是細胞治療潛在的種子細胞。但是，在誘導分化過程中由於(yu) 細胞分化程度不一，因而獲得特定分化階段的細胞對臨(lin) 床轉化中的療效和安全性都有重要意義(yi) 。在這種情況下，如何較快獲得高質量、足數量的目的細胞成為(wei) 細胞治療亟待解決(jue) 的問題。
那麽(me) ，如何解決(jue) 這個(ge) 問題，以推動間充質幹細胞的臨(lin) 床應用呢？長期探索該問題的中國科學院廣州生物醫藥與(yu) 健康研究院的研究團隊將這個(ge) 問題分解為(wei) 3個(ge) 部分：細胞來源、細胞質量以及細胞獲取方式。
在細胞來源方麵，間充質幹細胞可從(cong) 多種組織中獲取，但迄今為(wei) 止，臍帶仍是的細胞來源。臍帶是胎兒(er) 與(yu) 母體(ti) 之間的紐帶，這股紐帶在分娩後通常被當做生物垃圾處理。但臍帶中蘊含著豐(feng) 富的間充質幹細胞，且使用臍帶間充質幹細胞不會(hui) 對母體(ti) 和胎兒(er) 產(chan) 生任何傷(shang) 害。在細胞質量方麵，臍帶間充質幹細胞在臨(lin) 床應用中體(ti) 現出其他來源幹細胞所不具備的*性，包括免疫原性低、副作用小等，是細胞治療的高質量選擇。在細胞獲取方式方麵，目前臍帶間充質幹細胞主要通過組織塊貼壁法獲得，但是這種方法需要花費較長的時間，而且操作過程複雜，從(cong) 得到臍帶到zui終收獲細胞通常需要14~22天，妨礙了細胞治療的臨(lin) 床應用。
為(wei) 了促進間充質幹細胞在組織工程和細胞治療中的應用，科研工作者提出了許多新的細胞分選策略，以提高細胞的分選效率：除了目前較為(wei) 流行的流式細胞術和免疫磁珠法外，還有基於(yu) 細胞大小和密度的分選方法、基於(yu) 沉降作用的分選方法以及發展的基於(yu) 核酸識別細胞表麵抗原的分選方法等，但這些方法或是分選純度不高，或是操作複雜、成本較高、對儀(yi) 器依賴性強等，均不適用於(yu) 大規模分選細胞。另外，流式細胞術中應用了熒光素標記抗體(ti) ，分選後熒光素的存在會(hui) 影響細胞的後續培養(yang) ，而免疫磁珠法分選的細胞磁珠仍殘留在細胞上，也會(hui) 造成一定的細胞毒性，雖然有些磁珠分選方法可通過酶消化zui終除去磁珠，但酶消化的同時也會(hui) 破壞細胞表麵抗原分子的結構。麵對細胞分選技術麵臨(lin) 的種種問題，研究團隊希望研製出簡單、快速、有效、無損、可逆，能夠規模化獲取間充質幹細胞並且不影響細胞的生存率和生物功能的細胞分選方法，目前已初步找到了兩(liang) 種潛力的方案。
研究團隊的*種方案利用了海藻酸和生物素-親(qin) 合素係統（Biotin-Avidin System，BAS）。海藻酸是一種天然多聚糖，是構成海藻的細胞壁和細胞間質的主要成分；它屬於(yu) 陰離子型共聚物，可以與(yu) 金屬離子結合形成各種海藻酸鹽，具有良好的生物相容性與(yu) 低毒性，而且具有很強的成膠能力，工業(ye) 上將海藻酸及其衍生物產(chan) 品統稱為(wei) 海藻膠或褐藻膠。除海藻酸外，商業(ye) 上有實用價(jia) 值的海藻酸衍生物為(wei) 水溶性的海藻酸鹽，包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、海藻酸銨、海藻酸丙二醇酯等，其中海藻酸鈉是製備多種海藻酸衍生物的*前體(ti) 。
海藻酸鈉屬於(yu) 陰離子多糖，其溶液可以與(yu) 多種物質混溶，同時也很容易與(yu) 除鎂離子以外的高價(jia) 陽離子、陽離子表麵活性劑及強酸鍵合形成凝膠沉澱，且形成的凝膠結構具有熱不可逆性。但通過改變pH值和加入螯合物等條件可以使凝膠解聚，瓦解凝膠結構，改變這種不可逆性。當離子螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）存在時，鈣離子與(yu) EDTA結合，海藻酸鈣凝膠失去鈣離子而解聚，重新形成水溶性的海藻酸。根據這一可逆過程，研究團隊製備了海藻酸修飾的磁性納米顆粒，形成了細胞無損可逆分選的基礎之一。
生物素-親(qin) 合素係統是20世紀70年代末發展起來的一種新型生物反應放大係統。生物素環形結構中的Ⅰ環為(wei) 咪唑酮環（又稱Ureido環），是與(yu) 親(qin) 合素結合的主要部位；生物素的Ⅱ環結構為(wei) 噻吩環，帶有一個(ge) 戊酸側(ce) 鏈，末端羧基是標記抗體(ti) 和酶的*結構。由於(yu) 生物素分子很小，因而抗體(ti) 分子和酶經生物素化後，仍能保持其原有活力不變；細胞經生物素化後仍能保持正常的分裂、增殖能力，因此生物素常作為(wei) 抗體(ti) 、酶和細胞的標記。生物素-親(qin) 合素係統的高度特異性、高度靈敏性是實現細胞無損可逆分選的另一基礎。
在基於(yu) 海藻酸的自組裝和生物素-親(qin) 和素係統的細胞分選方法中，研究團隊首先將海藻酸用鏈酶親(qin) 和素標記，並將其修飾在海藻酸包裹的磁性納米顆粒上，然後對靶標分子的抗體(ti) 進行生物素標記；當抗體(ti) 與(yu) 細胞孵育並結合到相應細胞表麵標誌物上後，再與(yu) 鏈酶親(qin) 和素修飾的磁性納米顆粒孵育，通過生物素-親(qin) 和素係統的特性將細胞與(yu) 磁性納米顆粒鏈接；zui後在磁性富集得到的目的細胞中加入EDTA，使海藻酸鈣瓦解、磁珠從(cong) 細胞上釋放，即可得到不含磁珠的目的細胞（見圖1）。該步驟可使用不同抗體(ti) 重複進行，直至得到目的細胞。
通過這種方法，研究團隊成功從(cong) 臍帶中分離得到了臍帶間充質幹細胞，分選效率高達90%（見圖2），得到的細胞數目為(wei) 每厘米150萬(wan) ~200萬(wan) 個(ge) ，遠高於(yu) 傳(chuan) 統組織塊貼壁法所得到的細胞數目（每厘米2.5萬(wan) ～25萬(wan) 個(ge) ），且得到的細胞經過誘導能夠分化為(wei) 骨細胞和脂肪細胞
研究團隊的另一種方案利用了生物素/D-脫硫生物素與(yu) 鏈黴親(qin) 和素的結合能力差異，被稱為(wei) “基於(yu) 生物素/D-脫硫生物素素競爭(zheng) 結合鏈黴親(qin) 和素的細胞分選方法”。D-脫硫生物素是生物機體(ti) 合成生物素的原料，是不含硫的生物素類似物，其與(yu) 親(qin) 和素的結合能力是生物素的十萬(wan) 分之一，因而當D-脫硫生物素與(yu) 親(qin) 和素結合時能夠在溫和的條件下被生物素競爭(zheng) 取代，從(cong) 而保證被分選細胞和大分子的完整性。
與(yu) 生物素一樣，親(qin) 和素上同樣也有4個(ge) D-脫硫生物素的結合位點，因而可利用生物素-親(qin) 和素係統級聯放大信號的作用，將傳(chuan) 統的免疫磁珠細胞分選方法進行改良，使細胞表麵的抗原放大，更易於(yu) 被捕獲；此外，有些細胞表麵標記物表達量較低，也可通過這種級聯放大提高捕獲效率。
該方法的實施過程為(wei) ：將靶標分子的抗體(ti) 用D-脫硫生物素進行標記後與(yu) 細胞孵育，通過抗原-抗體(ti) 結合捕獲目的細胞，將其與(yu) 親(qin) 和素標記的磁珠進行孵育，使細胞富集到磁珠上，磁性富集即可分離目的細胞，zui後通過與(yu) 生物素孵育使細胞從(cong) 磁珠上釋放，得到不含磁珠的目的細胞（見圖4）。該方法無須使用熒光素標記抗體(ti) 和抗體(ti) 標記磁珠，避免了熒光素和磁珠可能對細胞產(chan) 生的細胞毒性，為(wei) 細胞的後續增殖和使用提供了質量保障。除此之外，該方法獲得的細胞不僅(jin) 不含磁珠，而且細胞上的殘留物更少，在保證目的細胞表麵蛋白不受破壞的前提下，為(wei) 獲得“純淨”的細胞提供了新的思路。
基於(yu) 臍帶間充質幹細胞在臨(lin) 床應用中顯示出的其他幹細胞*的*性，研究團隊對該方法的實際可行性進行了驗證，結果表明，與(yu) 傳(chuan) 統的免疫磁珠分選法相比，采用該方法分選得到的細胞增殖效率沒有明顯差別（見圖5）。
研究團隊綜合利用海藻酸的自組裝、生物素、D-脫硫生物素競爭(zheng) 結合鏈黴親(qin) 和素、生物素-鏈黴親(qin) 和素係統，旨在建立細胞無損可逆分選的新策略，為(wei) 快速、簡便地獲得數量足夠、質量均一的臨(lin) 床級細胞提供理論依據和技術基礎，推動幹細胞應用的臨(lin) 床轉化。綜合看來，研究團隊建立並驗證的兩(liang) 種方法能夠簡便、快速地獲得目的細胞，可以滿足臨(lin) 床上短期內(nei) 對特定類型細胞的大量需求，具有重要的實用價(jia) 值；同時還能為(wei) 基礎研究中獲得特定階段、特定類型的細胞提供技術支撐，節約時間和成本。因而，這兩(liang) 種方法對幹細胞的基礎研究和應用轉化均有重要的參考價(jia) 值。
基於(yu) 在無損、可逆分選細胞方法方麵的進展和突破，研究團隊將繼續進行探索和研究，圍繞“簡單、快速地獲得不含任何外源物（包括抗體(ti) ）的目的細胞”這一*目標，在後續工作中開發出更好的技術與(yu) 設備，為(wei) 推動幹細胞的理論研究和轉化應用提供先進的
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